灿烂弧菌快速检测技术研究进展
发布时间:2013-12-06  

 

        灿烂弧菌(Vibrio splendidus)广泛分布在世界各地的沿海区域,它对多种海洋动物都具有致病性。研究发现,灿烂弧菌能够引起扇贝幼苗、大菱鲆、牡蛎和刺参的大量死亡。这种致病菌能引起被感染的鱼体两侧特别是靠近尾部出现出血点,皮肤腐烂,严重的形成溃疡,背鳍、胸鳍、尾鳍的鳍条基部充血,肾脏、肝脏糜烂等症状,还能导致刺参出现“腐皮综合症”。
目前常用的检测方法有生化鉴定、PCR、实时定量PCR等。生化鉴定工作量大,需要至少3天的时间。PCR和实时定量PCR等现代检测技术虽然可以满足快速的检测要求,但是需要专业技术人员,昂贵的试剂和检测设备,这限制了其广泛应用。
        本项目研究了一种现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法,即利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplication, LAMP)的方法。LAMP技术是一种在等温条件下高特异性、高效、快速扩增靶基因的DNA扩增技术。LAMP主要依赖一种具有链置换活性的DNA聚合酶,识别6-8个区域的4-6条引物,在等温条件下(约60~65℃)快速、特意地扩增靶基因。扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的颈环结构和多环花椰菜样结构的DNA混合物,电泳后在凝胶上形成梯子行条带。也可以直接通过肉眼观测反应产物种是否形成白色沉淀来判断靶序列扩增与否。还可以通过向反应管中加入稀释10倍的GeneFinderTM核酸染料,通过颜色变化来判断是否存在靶序列扩增,颜色变绿,说明发生了LAMP特异性扩增,颜色仍为橙色说明没有扩增反应。
         本项目利用LAMP技术,以灿烂弧菌的gyrB基因作为模板进行反应体系的优化,实验结果显示在温度57.5℃~65,反应时间30~60 min,Mg2+浓度3~7 mM,dNTP浓度0.6~1.2 mM之间出现梯形带,经过多次重复实验,确定最佳温度为65℃,反应时间为45 min,Mg2+浓度为5 mM,dNTP浓度为1.0 mM。经超微量核酸蛋白测定仪测得灿烂弧菌基因组DNA的浓度为25.3 ng/µl,对其进行10倍系列梯度稀释,进行LAMP扩增,结果显示这个方法的最低检出限为2.53×10-5 ng/µl。这项检测方法不需要昂贵的仪器设备和很长的检测时间,即使在病原极少的情况下也能够检测出来,具有操作简便、成本低廉、检测准确等优点,可以做到实时监控,及时发现疫情,减少疫病的发病趋势,早期预防病原蔓延,避免给养殖户带来更大的损失。
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